新芝平行生物反應器 | Capacity or Responsibility

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Introduction

生物反應器是用于微生物和細胞的體外培養，并通過(guò)生化反應或發(fā)酵過(guò)程獲取產(chǎn)物的裝置，是生物合成、生物發(fā)酵、生物制藥領(lǐng)域中關(guān)鍵的設備之一。而平行生物反應器可同一系統控制多個(gè)單元，使其保持各項參數的高度一致性，是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設計方案重要的環(huán)節，其核心功能是高通量篩選（high-throughput screening）和工藝放大。

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Application

Background

藻藍素（Phycocyanobilin，PCB）天然存在于藍藻光感應系統中，在光能的吸收和傳遞中起著(zhù)至關(guān)重要的作用，在光遺傳學(xué)的研究中被廣泛應用。由于其具有亮麗的天藍色，可以作為天然色素在食品飲料中呈色，安全健康，營(yíng)養豐富，是FDA唯一批準的藍色食品添加劑。PCB還具有抗氧化、消除自由基、修復細胞延緩衰老、保水抗凍的作用，廣泛應用于化妝品領(lǐng)域。此外，作為一種安全的藥物，口服PCB在體內可以轉化為NADPH氧化酶的有效抑制劑，在治療阿爾茨海默癥方面表現出巨大潛力；PCB對冠狀病毒主要蛋白酶的活性也具有潛在的抑制作用，有潛力應用于防治近年來(lái)爆發(fā)的新型冠狀肺炎病毒。目前，PCB的獲取方法主要采用高溫甲醇分解法從螺旋藻中提取。該方法存在諸多問(wèn)題：（1） 甲醇高溫熱解需要耗費大量的能量，造成能源浪費；（2） 螺旋藻中與PCB共存的其他色素，如葉綠素、葉黃素等一系列前體，對后期產(chǎn)物純化有不利影響；（3）螺旋藻生長(cháng)周期較長(cháng)，限制了藻藍素的生產(chǎn)效率和應用。因此，從天然藻類(lèi)中提取高純度的PCB是一項復雜且不經(jīng)濟的方法，而采用合成生物學(xué)的方法合成PCB具有降低成本、節約能源和提高純度的優(yōu)點(diǎn)，目前已有研究人員在5 L發(fā)酵罐實(shí)現了PCB世界最高水平合成。

Strategy

首先，通過(guò)比較選擇了來(lái)源于T. elongatus的HO1和來(lái)源于Synechocystis sp的PcyA來(lái)合成PCB，在此基礎上，確定了含有強誘導啟動(dòng)子(T7lac)的高拷貝數質(zhì)粒(pRSFDuet-1)最適合表達這兩種酶(圖1，圖2)。

▲圖1 用于PCB合成的模塊?；疑珔^域包括參與ALA替代途徑（C4或C5途徑）的酶合成；紅色區域包括參與血紅素合成的酶和中間體；藍色區域包括參與PCB合成的酶和輔酶因子。

Figure 1. Modules for PCB synthesis. The gray block includes the enzymes involved in the alternative pathways (C4 or C5 pathway) for ALA synthesis; the red block includes enzymes and intermediates involved in heme synthesis; the blue block includes enzymes and cofactors involved in PCB synthesis.

▲圖2優(yōu)化HO和PcyA的表達策略以合成藻藍素。（a）從不同來(lái)源選擇HO和PcyA；（b）HO1和PcyA表達的質(zhì)粒和啟動(dòng)子的優(yōu)化。藍色和深灰色條表示PCB和分別為OD600。

Figure 2. Optimize the expression strategy of HO and PcyA to synthesize phycocyanin. (a) Selection of HO and PcyA from different sources; (b) optimization of plasmids and promoters for HO1 and PcyA expression. The blue and dark-gray bars represent the concentrations of PCB and OD600, respectively.

此外，在中等拷貝數的pCDFDuet-1載體中，采用DNA支架以2:1的比例實(shí)現HO1和PcyA的有效組裝(圖3)。

▲圖3通過(guò)DNA支架調節HO和PcyA比例促進(jìn)藻藍素合成

Figure 3. Regulation of HO and PcyA ratio by the DNA scaffold to improve PCB synthesis.

隨后，通過(guò)直接補充血紅素前體ALA和適度過(guò)表達血紅素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶(HemB和HemH)，增加細胞內前體物質(zhì)供應，促進(jìn)PCB合成。由于催化血紅素合成PCB的兩步酶促反應都伴隨著(zhù)鐵氧還蛋白（Fd）和Fd-NADP+還原酶（Fnr）的循環(huán)再生，研究人員通過(guò)表達nadK基因（編碼NAD+激酶）來(lái)加速輔因子循環(huán)，進(jìn)一步增強了PCB合成（圖4）。

▲圖4 PCB合成中的輔因子增強循環(huán)

Figure 4. Enhanced cycle of cofactors for PCB synthesis.

此外，研究人員還通過(guò)添加還原劑作為輔助，發(fā)現當培養基中加入維生素C或谷胱甘肽時(shí)，藻藍素產(chǎn)量會(huì )得到提高，進(jìn)一步優(yōu)化了維生素C的添加量，發(fā)現添加5 g/L維生素C時(shí)，最適合PCB生產(chǎn)。

最后，分別在搖瓶和發(fā)酵罐水平對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化（圖5）。

▲圖5在5L發(fā)酵罐中放大分批和補料分批發(fā)酵。（a）分批發(fā)酵；（b）600g補料分批發(fā)酵/L葡萄糖和8g/L MgSO4·7H₂O；（c）通過(guò)添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O和200 mg/L FeSO₄·7H₂O進(jìn)行補料分批發(fā)酵；（d）通過(guò)添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O、200 mg/L FeSO₄·7H₂O和5 g/L(NH₄)₂SO₄進(jìn)行補料分批發(fā)酵

Figure 5. Scale-up batch and fed-batch fermentation in a 5 L fermenter. (a) Batch fermentation; (b) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose and 8 g/L MgSO₄·7H₂O; (c) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, and 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O; (d) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O, and 5 g/L (NH₄)₂SO₄

在搖瓶水平，在30℃條件下用0.8 mM IPTG誘導，采用含有200mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H?O和5 g/L維生素C的MR培養基有利于提高PCB的產(chǎn)量。在發(fā)酵罐水平，采用pH-stat法進(jìn)行補料分批發(fā)酵，添加600g/L葡萄糖、8g/L MgSO4·7H?O和200 mg/L FeSO4·7H?O，在發(fā)酵罐水平獲得藻藍素28.32 mg/L，是至今報道的最高產(chǎn)量。此研究為在大腸桿菌中合成藻藍素或血紅素衍生物及其他天然色素提供了策略。

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Conclusion

提取耗能大、純化復雜且原料獲取周期長(cháng)的藻藍素通過(guò)生物合成的方法實(shí)現了目前發(fā)酵最高的產(chǎn)量，以大腸桿菌為工程菌成功構建PCB完整代謝通路，通過(guò)基因調控手段（過(guò)表達關(guān)鍵酶及相關(guān)酶上游基因等）和輔料添加來(lái)促進(jìn)PCB的合成，再于生物反應器內對菌種進(jìn)行放大培養并對培養條件進(jìn)行優(yōu)化，采取補料分批發(fā)酵的方法在5 L發(fā)酵罐水平獲得了PCB的高產(chǎn)量合成。

合成生物學(xué)是從原料到菌種再到產(chǎn)品的全鏈條設計和優(yōu)化，可以在改造和優(yōu)化天然表達體系的同時(shí)，將動(dòng)物源和植物源的代謝路徑構建到微生物體系中，重新合成全新的人工生物體系，最終實(shí)現目標代謝物的異源表達，將原料以較高的速率最大限度地轉化為產(chǎn)物。而平行生物反應器是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設計方案重要的環(huán)節，其核心功能是高通量篩選和工藝放大，研究目標菌種在較大培養體系下的生長(cháng)行為，優(yōu)化生長(cháng)pH、補料速度、攪拌速度、誘導劑添加、通氣量等培養條件，實(shí)時(shí)監測體系內溶氧、溫度等生長(cháng)參數，多個(gè)反應器同時(shí)控制，使發(fā)酵過(guò)程一致，發(fā)酵結果具有一致性與平行性?！靶轮ァぶ髟盡PB平行生物反應器，針對不同培養需求設計開(kāi)發(fā)了500 mL、1000 mL和2400 mL三款不同容積的發(fā)酵設備，單元模塊數量可按需拓展，適用于菌種的發(fā)酵工藝優(yōu)化、工藝固定的菌種高通量篩選、最適培養基篩選等方向，涉及基因工程、生物制藥、酶工程、合成測序、代謝途徑/ 網(wǎng)路及生物底盤(pán)的設計與改造等多個(gè)領(lǐng)域。平行生物反應器上下游行業(yè)廣泛，是研究合成生物學(xué)的得力助手，如有興趣，期待您的咨詢(xún)。

圖源：DOI: 10.1021/acssynbio.2c00016